Produktet
Kompleti i zbulimit të Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR për 2019-nCoV
Përdorimi i pritshëm
Ky komplet përdoret për zbulimin cilësor të koronavirusit të ri (2019-nCoV) duke përdorur tamponët e fytit, tamponët nazofaringeal, lëngun e lavazhit bronkoalveolar, sputumin. Rezultati i zbulimit të këtij produkti është vetëm për referencë klinike dhe nuk duhet të përdoret si i vetmi dëshmi për diagnozën dhe trajtimin klinik. Rekomandohet një analizë gjithëpërfshirëse e gjendjes në kombinim me manifestimet klinike të pacientit dhe teste të tjera laboratorike.
Parimi i inspektimit
Kompleti bazohet në teknologjinë RT-PCR me një hap.Në fakt, gjenet ORF1ab dhe N të koronavirusit të ri 2019 (2019-nCoV) u zgjodhën si rajonet e synuara të amplifikimit.Primerët specifikë dhe sondat fluoreshente (sondat e gjenit N janë etiketuar me FAM dhe sondat ORF1ab janë etiketuar me HEX) janë krijuar për të zbuluar ARN-në e koronavirusit të tipit të ri 2019 në mostra.Kompleti përfshin gjithashtu një sistem zbulimi endogjen të kontrollit të brendshëm (sondë gjene e kontrollit të brendshëm të etiketuar me CY5) për të monitoruar procesin e mbledhjes së mostrës, ARN dhe amplifikimin PCR, duke reduktuar kështu rezultatet false negative.
Komponentët kryesorë
| Komponentët | Vëllimi(48T/Kit） |
| Zgjidhja e reaksionit RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer sondë përzierje TaqMan (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864 µl |
| Kontroll negativ | 1500 μl |
| nCOV kontroll pozitiv (l gjen ORF1ab N) | 1500 μl |
Reagentët e vet: reagentët për nxjerrjen ose pastrimin e ARN-së.Kontrolli negativ/pozitiv: Kontrolli pozitiv është ARN që përmban fragmentin e synuar, ndërsa kontrolli negativ është uji pa acid nukleik.Gjatë përdorimit, ato duhet të marrin pjesë në nxjerrjen dhe duhet të konsiderohen infektive.Ato duhet të trajtohen dhe asgjësohen në përputhje me rregulloret përkatëse.
Gjeni i brendshëm i referencës është gjeni i njeriut RnaseP.
Kushtet e ruajtjes dhe data e skadencës
-20±5℃, shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur më shumë se 5 herë, e vlefshme për 6 muaj.
Instrumenti i aplikueshëm
Me FAM / HEX / CY5 dhe instrumente të tjera fluoreshente PCR me shumë kanale.
Kërkesat e mostrës
1. Llojet e aplikueshme të ekzemplarëve: tamponët e fytit, shtupa nazofaringeale, lëngu i lavazhit bronkoalveolar, sputum.
2. Grumbullimi i mostrave (teknika aseptike)
Tampon faringuale: Fshini bajamet dhe murin e pasmë të faringut me dy shtupë në të njëjtën kohë, më pas zhytni kokën e shtupës në një epruvetë që përmban tretësirën e kampionimit
Pështymë: Pasi pacienti të ketë një kollë të thellë, mblidhni sputumin e kollitur në një provëz me kapak me vidë që përmban tretësirën e marrjes së mostrave;Lëngu i lavazhit bronkoalveolar: Marrja e mostrave nga profesionistë mjekësorë.3. Ruajtja dhe transporti i mostrave
Mostrat për izolimin e virusit dhe testimin e ARN-së duhet të testohen sa më shpejt të jetë e mundur.Mostrat që mund të zbulohen brenda 24 orëve mund të ruhen në 4℃;ato që nuk mund të zbulohen brenda 24
orët duhet të ruhen në -70℃ ose më poshtë (nëse nuk ka kushte magazinimi prej -70℃, ato duhet të jenë
ruhet përkohësisht në -20℃ frigorifer).Mostrat duhet të shmangin ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur gjatë transportit.Mostrat duhet të dërgohen në laborator sa më shpejt të jetë e mundur pas grumbullimit.Nëse mostrat duhet të transportohen në distanca të gjata, rekomandohet ruajtja e akullit të thatë.
Metodat e Testimit
1 Përpunimi i mostrës dhe nxjerrja e ARN-së (zona e përpunimit të mostrës)
Rekomandohet të merren 200 μl kampion të lëngshëm për nxjerrjen e ARN-së.Për hapat përkatës të nxjerrjes, referojuni udhëzimeve të kompleteve komerciale të nxjerrjes së ARN-së.Si negative ashtu edhe negative
kontrollet në këtë komplet u përfshinë në nxjerrjen.
2 Përgatitja e reagentit PCR (zona e përgatitjes së reagentit)
2.1 Hiqni të gjithë përbërësit nga kompleti dhe shkrini dhe përzieni në temperaturën e dhomës.Centrifugoni në 8000 rpm për disa sekonda përpara përdorimit;llogaritni sasinë e kërkuar të reagentëve dhe sistemi i reagimit përgatitet siç tregohet në tabelën e mëposhtme:
| Komponentët | Shërbim N (sistemi 25µl) |
| nCOV primer sondë përzierje TaqMan | 18 µl × N |
| Zgjidhja e reaksionit RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numri i mostrave të testuara + 1 (kontroll negativ) + 1 (nCOVkontroll pozitiv) | |
2.2 Pas përzierjes së plotë të përbërësve, centrifugoni për një kohë të shkurtër që i gjithë lëngu në murin e tubit të bjerë në fund të tubit dhe më pas shpërndani sistemin e amplifikimit prej 20 µl në tubin PCR.
3 Marrja e mostrave (zona e përgatitjes së mostrës)
Shtoni 5 μl të kontrollit negativ dhe pozitiv pas nxjerrjes.ARN-ja e kampionit që do të testohet shtohet në tubin e reaksionit PCR.
Mbulojeni tubin fort dhe centrifugoni në 8000 rpm për disa sekonda përpara se ta transferoni në zonën e zbulimit të amplifikimit.
4 Amplifikimi PCR (zona e përforcuar e zbulimit)
4.1 Vendosni tubin e reagimit në qelizën e mostrës së instrumentit dhe vendosni parametrat si më poshtë:
| fazë | Cikli numri | Temperatura(°C) | Koha | mbledhjesfaqe |
| E kundërtatranskriptimi | 1 | 42 | 10 min | - |
| Para denatyrimin | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cikli | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-ta | Mbledhja e të dhënave |
Zgjedhja e kanalit të zbulimit të instrumentit: Zgjidhni kanalin FAM, HEX, CY5 për sinjalin e fluoreshencës.Për referencë fluoreshente ASNJË, ju lutemi mos zgjidhni ROX.
5 Analiza e rezultateve (Ju lutemi referojuni udhëzimeve eksperimentale të secilit instrument për vendosjen)
Pas reagimit, ruani rezultatet.Pas analizës, rregulloni vlerën fillestare, vlerën përfundimtare dhe vlerën e pragut të vijës bazë sipas imazhit (përdoruesi mund të rregullojë sipas situatës aktuale, vlera fillestare mund të vendoset në 3~15, vlera e përfundimit mund të vendoset në 5~20, rregullimi) në grafikun logaritmik Në pragun e dritares, vija e pragut është në fazën logaritmike, dhe kurba e amplifikimit të kontrollit negativ është një vijë e drejtë ose nën vijën e pragut).
6 Kontrolli cilësor (Një kontroll procedural është përfshirë në test) Kontroll negativ: Nuk ka kurbë të dukshme të amplifikimit për kanalet e zbulimit FAM, HEX, CY5
Kontroll pozitiv COV: kurba e dukshme e amplifikimit të kanaleve të zbulimit FAM dhe HEX, vlera Ct≤32, por pa kurbë amplifikimi të kanalit CY5;
Kërkesat e mësipërme duhet të plotësohen njëkohësisht në të njëjtin eksperiment;përndryshe, eksperimenti është i pavlefshëm dhe duhet të përsëritet.
7 Përcaktimi i rezultateve.
7.1 Nëse nuk ka kurbë amplifikimi ose vlerë Ct> 40 në kanalet FAM dhe HEX të kampionit të provës, dhe ka një kurbë amplifikimi në kanalin CY5, mund të gjykohet se nuk ka koronavirus të ri 2019 (2019-nCoV) ARN në mostër;
.2 Nëse kampioni i testit ka kurba të dukshme të amplifikimit në kanalet FAM dhe HEX, dhe vlera Ct është ≤40, mund të gjykohet se kampioni është pozitiv për koronavirusin e ri 2019 (2019-nCoV).
7.3 Nëse kampioni i provës ka një kurbë të qartë amplifikimi vetëm në një kanal të FAM ose HEX, dhe vlera Ct është ≤40, dhe nuk ka kurbë amplifikimi në kanalin tjetër, rezultatet duhet të ritestohen.Nëse rezultatet e ritestimit janë të qëndrueshme, kampioni mund të gjykohet të jetë pozitiv për të renë
koronavirus 2019 (2019-nCoV).Nëse rezultati i ritestimit është negativ, mund të gjykohet se kampioni është negativ për koronavirusin e ri 2019 (2019-nCoV).
Vlera e gjykimit pozitiv
Metoda e kurbës ROC përdoret për të përcaktuar vlerën e referencës CT të kompletit dhe vlera e referencës së kontrollit të brendshëm është 40.
Interpretimi i rezultateve të testit
1. Çdo eksperiment duhet të testohet për kontrolle negative dhe pozitive.Rezultatet e testit mund të përcaktohen vetëm kur kontrollet plotësojnë kërkesat e kontrollit të cilësisë
2.Kur kanalet e zbulimit FAM dhe HEX janë pozitive, rezultati nga kanali CY5 (kanali i kontrollit të brendshëm) mund të jetë negativ për shkak të konkurrencës së sistemit.
3. Kur rezultati i kontrollit të brendshëm është negativ, nëse kanalet e zbulimit FAM dhe HEX të epruvetës janë gjithashtu negative, do të thotë se sistemi është i çaktivizuar ose funksionimi është i gabuar, testi është i pavlefshëm.Prandaj, mostrat duhet të ritestohen.
