Produkte
Kit zbulimi Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR për 2019-nCoV
Përdorimi i pritur
Ky komplet përdoret për zbulimin cilësor të koronavirusit të ri (2019-nCoV) duke përdorur mostra nga fyti, mostra nga nazofaringeali, lëng nga lavazh bronkoalveolar dhe sputum. Rezultati i zbulimit të këtij produkti është vetëm për referencë klinike dhe nuk duhet të përdoret si e vetmja provë për diagnozën dhe trajtimin klinik. Rekomandohet një analizë gjithëpërfshirëse e gjendjes në kombinim me manifestimet klinike të pacientit dhe testet e tjera laboratorike.
Parimi i inspektimit
Seti bazohet në teknologjinë RT-PCR me një hap. Në fakt, gjenet ORF1ab dhe N të koronavirusit të ri të vitit 2019 (2019-nCoV) u përzgjodhën si rajone të synuara të amplifikimit. Prajmerë specifikë dhe sonda fluoreshente (sondat e gjenit N janë të etiketuara me FAM dhe sondat ORF1ab janë të etiketuara me HEX) janë projektuar për të zbuluar ARN-në e koronavirusit të tipit të ri të vitit 2019 në mostra. Seti gjithashtu përfshin një sistem zbulimi të kontrollit të brendshëm endogjen (sonda e gjenit të kontrollit të brendshëm e etiketuar me CY5) për të monitoruar procesin e mbledhjes së mostrës, ARN-në dhe amplifikimin e PCR, duke zvogëluar kështu rezultatet e rreme negative.
Komponentët kryesorë
| Komponentët | Vëllimi（48T/Kit） |
| Tretësirë reagimi RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer sondë përzierje TaqMan (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Kontroll negativ | 1500µl |
| nCOV kontroll pozitiv (l gjen ORF1ab N) | 1500µl |
Reagentët vetjakë: Reagentët e nxjerrjes ose pastrimit të ARN-së. Kontrolli negativ/pozitiv: Kontrolli pozitiv është ARN që përmban fragmentin e synuar, ndërsa kontrolli negativ është uji pa acid nukleik. Gjatë përdorimit, ato duhet të marrin pjesë në nxjerrje dhe duhet të konsiderohen infektive. Ato duhet të trajtohen dhe të asgjësohen në përputhje me rregulloret përkatëse.
Gjeni i referencës së brendshme është gjeni njerëzor RnaseP.
Kushtet e ruajtjes dhe data e skadimit
-20 ± 5℃, shmangni ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur më shumë se 5 herë, e vlefshme për 6 muaj.
Instrument i zbatueshëm
Me FAM / HEX / CY5 dhe instrumente të tjera PCR fluoreshente shumëkanalëshe.
Kërkesat e mostrës
1. Llojet e aplikueshme të mostrave: tampon fyti, tampon nazofaringeal, lëng lavazh bronkoalveolar, pështymë.
2. Mbledhja e mostrave (teknikë aseptike)
Tampon faringual: Fshini bajamet dhe murin e pasmë të faringut me dy tampona në të njëjtën kohë, pastaj zhytni kokën e tamponit në një provëz që përmban tretësirën e mostrës.
Sputumi: Pasi pacienti të ketë kollë të thellë, mblidhni pështymën e kollës në një epruvetë me kapak vidhos që përmban tretësirën e mostrës; lëngu i lavazhit bronkoalveolar: Marrja e mostrave nga profesionistë mjekësorë. 3. Ruajtja dhe transportimi i mostrave
Mostrat për izolimin e virusit dhe testimin e ARN-së duhet të testohen sa më shpejt të jetë e mundur. Mostrat që mund të zbulohen brenda 24 orëve mund të ruhen në 4℃; ato që nuk mund të zbulohen brenda 24
orët duhet të ruhen në -70℃ ose më poshtë (nëse nuk ka kushte ruajtjeje prej -70℃, ato duhet të jenë
Ruajeni përkohësisht në -20℃ frigorifer). Mostrat duhet të shmangin ngrirjen dhe shkrirjen e përsëritur gjatë transportit. Mostrat duhet të dërgohen në laborator sa më shpejt të jetë e mundur pas mbledhjes. Nëse mostrat duhet të transportohen në distanca të gjata, rekomandohet ruajtja në akull të thatë.
Metodat e Testimit
1 Përpunimi i mostrës dhe nxjerrja e ARN-së (zona e përpunimit të mostrës)
Rekomandohet të merren 200 μl mostër e lëngshme për nxjerrjen e ARN-së. Për hapat përkatës të nxjerrjes, referojuni udhëzimeve të kitave komerciale të nxjerrjes së ARN-së. Si negativi ashtu edhe negativi
Kontrollet në këtë kit ishin të përfshira në nxjerrje.
2 Përgatitja e reagentit PCR (zona e përgatitjes së reagentit)
2.1 Hiqni të gjithë përbërësit nga kompleti dhe shkrijini e përziejini në temperaturë ambienti. Centrifugojini në 8,000 rpm për disa sekonda para përdorimit; llogaritni sasinë e kërkuar të reagentëve dhe sistemi i reagimit përgatitet siç tregohet në tabelën e mëposhtme:
| Komponentët | N porcion (sistem 25µl) |
| nCOV primer sondë përzierje TaqMan | 18 µl × N |
| Tretësirë reagimi RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = numri i mostrave të testuara + 1 (kontroll negativ) + 1 (nCOVkontroll pozitiv) | |
2.2 Pasi të keni përzier plotësisht përbërësit, centrifugojeni për një kohë të shkurtër në mënyrë që i gjithë lëngu në murin e tubit të bjerë në fund të tij dhe më pas shpërndajeni sistemin e amplifikimit prej 20 µl në tubin PCR.
3 Marrja e mostrave (zona e përgatitjes së mostrave)
Shtoni 5μl të kontrolleve negative dhe pozitive pas nxjerrjes. ARN-ja e mostrës që do të testohet shtohet në tubin e reagimit PCR.
Mbylleni tubin fort me kapak dhe centrifugojeni në 8,000 rpm për disa sekonda përpara se ta transferoni në zonën e zbulimit të amplifikimit.
4 Amplifikim PCR (zona e zbulimit e amplifikuar)
4.1 Vendosni tubin e reagimit në qelizën e mostrës së instrumentit dhe vendosni parametrat si më poshtë:
| fazë | Biciklet numër | Temperatura(°C) | Koha | koleksionvend |
| Mbrapshttranskriptim | 1 | 42 | 10 minuta | - |
| Para-denaturimin | 1 | 95 | 1 minutë | - |
| Biciklet | 45 | 95 | 15 sekonda | - |
| 60 | 30-ta | mbledhjen e të dhënave |
Përzgjedhja e kanalit të zbulimit të instrumentit: Zgjidhni kanalin FAM, HEX, CY5 për sinjalin e fluoreshencës. Për sinjalin referues fluoreshent NONE, ju lutemi mos zgjidhni ROX.
5 Analiza e rezultateve (Ju lutemi referojuni udhëzimeve eksperimentale të secilit instrument për konfigurimin)
Pas reagimit, ruani rezultatet. Pas analizës, rregulloni vlerën fillestare, vlerën përfundimtare dhe vlerën prag të vijës bazë sipas imazhit (përdoruesi mund ta rregullojë sipas situatës aktuale, vlera fillestare mund të vendoset në 3~15, vlera përfundimtare mund të vendoset në 5~20, rregullim) në grafikun logaritmik. Në pragun e dritares, vija e pragut është në fazën logaritmike, dhe kurba e amplifikimit të kontrollit negativ është një vijë e drejtë ose nën vijën e pragut).
6 Kontroll i cilësisë (Një kontroll procedural është përfshirë në test) Kontroll negativ: Nuk ka kurbë të dukshme amplifikimi për kanalet e zbulimit FAM, HEX, CY5
Kontroll pozitiv COV: kurbë e dukshme amplifikimi të kanaleve të zbulimit FAM dhe HEX, vlera Ct ≤32, por pa kurbë amplifikimi të kanalit CY5;
Kërkesat e mësipërme duhet të përmbushen njëkohësisht në të njëjtin eksperiment; përndryshe, eksperimenti është i pavlefshëm dhe duhet të përsëritet.
7 Përcaktimi i rezultateve.
7.1 Nëse nuk ka kurbë amplifikimi ose vlerë Ct > 40 në kanalet FAM dhe HEX të mostrës së testimit, dhe ka një kurbë amplifikimi në kanalin CY5, mund të gjykohet se nuk ka ARN të koronavirusit të ri 2019 (2019-nCoV) në mostër;
.2 Nëse mostra e testimit ka kurba të dukshme amplifikimi në kanalet FAM dhe HEX, dhe vlera Ct është ≤40, mund të gjykohet se mostra është pozitive për koronavirusin e ri 2019 (2019-nCoV).
7.3 Nëse mostra e testimit ka një kurbë amplifikimi të qartë vetëm në një kanal të FAM ose HEX, dhe vlera Ct është ≤40, dhe nuk ka kurbë amplifikimi në kanalin tjetër, rezultatet duhet të ritestohen. Nëse rezultatet e ritestimit janë konsistente, mostra mund të gjykohet pozitive për testin e ri.
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Nëse rezultati i ritestimit është negativ, mund të gjykohet se mostra është negative për koronavirusin e ri të vitit 2019 (2019-nCoV).
Vlerë pozitive gjykimi
Metoda e kurbës ROC përdoret për të përcaktuar vlerën referuese CT të kitit dhe vlera referuese e kontrollit të brendshëm është 40.
Interpretimi i rezultateve të testit
1. Çdo eksperiment duhet të testohet për kontrolle negative dhe pozitive. Rezultatet e testit mund të përcaktohen vetëm kur kontrollet plotësojnë kërkesat e kontrollit të cilësisë.
2. Kur kanalet e zbulimit FAM dhe HEX janë pozitive, rezultati nga kanali CY5 (kanali i kontrollit të brendshëm) mund të jetë negativ për shkak të konkurrencës së sistemit.
3. Kur rezultati i kontrollit të brendshëm është negativ, nëse kanalet e zbulimit FAM dhe HEX të provëzës janë gjithashtu negative, kjo do të thotë që sistemi është i çaktivizuar ose funksionimi është i gabuar, testi është i pavlefshëm. Prandaj, mostrat duhet të ritestohen.
